2×In-Fusion Cloning Mix Plus

 

Naziv proizvoda	Cat. br.	Spec.
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	G3351-20T	20 T
	G3351-100T	100 T

 

2×In-Fusion Cloning Mix Plus nudi povećanu efikasnost kloniranja u odnosu na prethodne generacije In-Fusion kompleta (G3350,2×In-Fusion Cloning Mix), posebno za više fragmenata. Dizajniran je za brzo, usmjereno kloniranje jednog ili 2~5 višestrukih fragmenata DNK u bilo koji vektor. On spaja fragmente DNK (npr. PCR generirane inserte i linearizirane vektore) efikasno i precizno prepoznajući 15-25 bp preklapanja na njihovim krajevima. Ova 15-25 bp preklapanja mogu se konstruirati dizajniranjem prajmera za amplifikaciju željenih sekvenci. Istovremeno umetanje više fragmenata uvelike pojednostavljuje eksperimentalne korake, poboljšava efikasnost kloniranja i štedi vaše vrijeme.

 

1. Dizajn prajmera sa jednim fragmentom: 15-25 bp sekvence u skladu sa oba kraja linearizovanog vektora uvedene su u 5' kraj amplifikacije prajmera umetka. Dizajnirajte dijagram ispod:

2. Dizajn prajmera sa više fragmenata: Principi dizajna prajmera na oba kraja vektora su isti kao i kod jednofragmentnih prajmera. Reset zona između principa dizajna prajmera fragmenta je kako slijedi: Postoji 15-25 bp preklapanje između obrnutog prajmera fragmenta 1 i prednjeg prajmera fragmenta 2. Reverzni prajmer za fragment 1 uključuje preklapajuću regiju i reverznu specifičnu prajmer region, prednji prajmer za Fragment 2 uključuje region koji se preklapa i prednji specifičan prajmer region, i tako dalje (preklapajući regioni su prikazani crvenom bojom). Da bi se poboljšala efikasnost, preklapajuća područja između fragmenata mogu se povećati i njihove Tm vrijednosti su zagarantovane konzistentne. Dizajn je sljedeći:

 

 

Brod s mokrim ledom; pohranjen na -20 stepen, važi 12 mjeseci.

 

 

Komponenta	G3351-20T	G3351-100T
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	100 μL	5 x 100 μL
pUC19 (lineariziran, kontrolni vektor, 5 ng/μL)	10 μL	10 μL
Kontrolni umetak (10 ng/μL)	10 μL	10 μL
Manual	Jedan primjerak

 

 

Izvršite reakciju ligacije

1. U autoklaviranu epruvetu za mikrocentrifugu od 1.5-ml dodajte sljedeće (preporučite 10-uL reakcijski sistem):

Komponenta	Volume
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	5 μL
Vektorska DNK	X μL
Ubacite DNK	Y μL
Voda bez nukleaze	Dodajte u 10 μL

 

2. Lagano promiješajte i kratko centrifugirajte kako biste sadržaj doveli na dno epruvete.

3. Za reakcije rekombinacije sa jednim fragmentom, inkubirajte na 50 stepeni 15 minuta; Za rekombinaciju više fragmenata, inkubirajte na 50 stepeni 30 minuta.

 

NAPOMENA:Za rekombinaciju više fragmenata 3-5, povećanje vremena reakcije će dati više kolonija, ali ne bi trebalo da prelazi 1 h).

4. Stavite epruvetu na led i odmah pređite na "Izvršite reakciju transformacije".

 

 

5. Dodajte odgovarajuću reakciju ligacije u hemijski kompetentnu E. coli (kao što je DH5, Top10, itd.) i lagano promiješajte. Nemojte miješati pipetiranjem gore-dolje.

6. Inkubirajte 30 minuta na ledu.

7. Toplotni šok na ćelije u trajanju od 30 sekundi u vodenom kupatilu od 42 stepena.

8. Odmah stavite epruvete na led i inkubirajte 2 minute.

9. Dodajte 900 µL SOC ili LB medija sobne temperature. Čvrsto zatvorite epruvetu i protresite je horizontalno na 225 o/min 1 sat na 37 stepeni.

10. Rasporedite potrebnu zapreminu reakcije transformacije na prethodno zagrejanu LB ploču koja sadrži odgovarajuće antibiotike.

11. Inkubirajte ploče preko noći na 37 stepeni.

 

 

Izaberite pojedinačnu koloniju sa transformacione ploče, analizirajte transformante pomoću PCR kolonije ili digestije restrikcijskim enzimima.

 

 

1. DNK vektora i DNK umetanja treba pročistiti u gelu i analizirati njihov kvalitet i koncentraciju elektroforezom. Voda se može izostaviti u reakciji ligacije ako je koncentracija niska.

2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 stepeni.

3. Preporučuje se da molarni odnos vektora i inserta bude 1:1~1:3; kada su 2-3 fragmenti povezani, molarni odnos između svakog fragmenta je 1:1, a sistem reakcije ligacije može se povećati u jednakim proporcijama.

4. Ako je ukupni volumen vektora i inserta veći od 5 μL, možete skalirati sistem ligacije na 20 μL.

5. Volumen proizvoda za ligiranje ne bi trebao prelaziti 1/10 volumena kompetentnih ćelija, inače će efikasnost transformacije biti značajno smanjena. Volumen proizvoda ligacije i kompetentnih ćelija može se povećati u jednakim proporcijama (na primjer, 20 μL ligacionog sistema transformira 200 μL kompetentnih ćelija).

6. 2×Universal Ligation Mix treba držati na -20 stepenu do 5-10 minuta upotrebe i odmah vratiti na -20 stepen nakon upotrebe. Preporučuje se zamrzavanje u alikvotima kako bi se smanjili ciklusi zamrzavanja-odmrzavanja.

7. Ako se za transformaciju koristi elektroporacija, DNK vektora i DNK umetanja treba pročistiti metodom kolone ili metodom precipitacije etanolom.

 

 

1. Eksperimentalni dijagram procesa konstrukcije rekombinantnog plazmida

 

A. Insert DNK fragmenti su dobijeni PCR amplifikacijom: Homologna sekvenca 15-25 bp (zelena i svijetloplava) sa lineariziranog kraja vektora uvedena je u 'kraj naprijed/obrnutih prajmera ciljnog fragmenta, a 5' i 3' krajnje sekvence amplificiranog proizvoda bile su potpuno konzistentne sa dvije krajnje sekvence lineariziranog vektora, respektivno.

B. Linearizacija plazmidnog vektora: Restrikcijska endonukleaza ili reverzni PCR korišteni su za dobivanje lineariziranih vektora.

C. In-Fusion Cloning Plus: linearizovani nosač i prečišćeni i oporavljeni fragment umetka su pomešani u proporciji, a reakcija je završena na 50 stepeni tokom 15 minuta.

D. Transformirane ćelije: Reakcioni proizvodi direktno u kompetentne ćelije escherichia coli, rast monoklonske kolonije izdvaja se iz tablete za PCR, enzimsku digestiju i sekvenciranje eksperimentalnog skrininga pozitivnih klonova.

 

2. Eksperimentalni dijagram procesa konstruiranja rekombinantnog plazmida mutacije u jednoj tački

A. PCR sa dva fragmenta (PCR amplificira fragmente DNK na oba kraja mjesta mutacije): Komplementarni prajmeri su dizajnirani na mjestu mutacije (narandžasto), a prajmeri su dizajnirani na oba kraja mutantnog gena da uvedu homologne sekvence na kraju lineariziranog vektora 15-25 bp (zelena i svijetloplava). Koristeći različite prajmere za PCR amplifikaciju, respektivno, mutacije u dva dela sa homolognim sekvencama dva umetnuta fragmenta (uključuju) mutacije gena, respektivno.

B. Linearizacija plazmidnog vektora: Restrikcijska endonukleaza ili reverzni PCR korišteni su za dobivanje lineariziranih vektora.

C. In-Fusion Cloning Plus: linearizovani nosač i prečišćeni i oporavljeni fragment umetka su pomešani u proporciji, a reakcija je završena na 50 stepeni tokom 15 minuta.

D. Transformirane ćelije: Reakcioni proizvodi direktno u kompetentne ćelije escherichia coli, rast monoklonske kolonije izdvaja se iz tablete za PCR, enzimsku digestiju i sekvenciranje eksperimentalnog skrininga pozitivnih klonova.

 

3. Šematski dijagram eksperimentalnog procesa konstrukcije rekombinantnog plazmida ubacivanjem više fragmenata

A. PCR amplifikacija dodatnih fragmenata: Homologne sekvence (označene zelenom, tamnoplavom, žutom i svijetloplavom) dodane su na 5' kraj amplifikacije prajmera, tako da je postojala 15-25 bp homologna sekvenca između produkata amplifikacije i između produkata amplifikacije i lineariziranog vektora. Različiti parovi prajmera korišćeni su za amplifikaciju DNK fragmenata (označeni narandžasto, crveno i ljubičasto).

B. Linearizacija plazmidnog vektora: Restrikcijska endonukleaza ili reverzni PCR korišteni su za dobivanje lineariziranih vektora.

C. In-Fusion Cloning Plus: linearizovani nosač i prečišćeni i oporavljeni fragment umetka su pomešani u proporciji, a reakcija je završena na 50 stepeni tokom 15 minuta.

D. Transformirane ćelije: Reakcioni proizvodi direktno u kompetentne ćelije escherichia coli, rast monoklonske kolonije izdvaja se iz tablete za PCR, enzimsku digestiju i sekvenciranje eksperimentalnog skrininga pozitivnih klonova.

 

Samo za istraživačku upotrebu!

 

 

Popularni tagovi: 2×u fuziji kloniranje miks plus, Kina 2×u fuziji mješavina za kloniranje plus proizvođači, dobavljači, tvornica